Cultivo "in vitro"

El cultivo in vitro es un método de propagación de plantas de aplicación profesional, puesto que se realiza en laboratorio, en unas condiciones estériles y con unas instalaciones especiales.

El desarrollo del cultivo in vitro de tejidos vegetales a permitido el establecimiento de nuevos métodos de propagación en especies de reproducción vegetativa y ha contribuido a complementar los trabajos de mejoramiento genético en diferentes especies. Además de ofrecer nuevas alternativas para la conservación ex situ del germoplasma. La conservación in vitro puede aplicarse en especies donde se encuentran establecido un sistema de regeneración de plantas.

El método de conservación in vitro más generalizado es el denominado “crecimiento mínimo”. Se basa en modificaciones de las condiciones óptimas de cultivo con el objeto de disminuir el crecimiento vegetal. De esta manera, se puede reducir la frecuencia de trasferencia de las plantas a medios de cultivo fresco. Recientemente la conservación de germoplasma de plantas está implicando la inmersión directa dentro de nitrógeno líquido y el procedimiento de vitrificación ha demostrado ser el más prometedor entre ellos. El mismo ha sido empleado por numerosos investigadores en diferentes especies. La crioconservación garantiza la conservación in vitro del germoplasma durante periodos prolongados de tiempo.

El cultivo in vitro consiste en tomar un trocito de hoja, un embrión, una porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otra parte de una planta y ponerla a cultivar en un tubo de ensayo sobre un medio acuoso nutritivo.

Lo fundamental es que se hace en unas condiciones muy controladas y totalmente estériles: utensilios, cámara de manipulación, etc., todo está desinfectado en autoclave.
El cultivo in vitro es muy caro, entre otras cosas porque no se puede mecanizar. Sólo son rentables aquellos laboratorios muy grandes y con mucho mercado.

La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.

Fase de aclimatación en invernadero

Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro:

• • Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas:
    - Micropropagación de estaquillas
    - Organogénesis de callos

• • Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas:
    - Cultivo de meristemos
    - Microinjerto in vitro

• • Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.

• • Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.

• • Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.

• • Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.

• • Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.

• Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas:- Obtención rápida de homocigotos.- Producción de híbridos (frutos puros).

Equipo necesario para el cultivo in vitro

- Autoclave
- Cámara de flujo laminar
- Medio de cultivo
- Planta
- Cámara de cultivo

- Autoclave

Es donde se "esteriliza" todo lo que vamos a utilizar: agua, algunos nutrientes, material, etc. No se pueden meter proteinas. Es como una olla a presión, pero de mayor tamaño, donde se controla la presión y la temperatura (hasta 120º).

- Cámara de flujo laminar

Es donde se realizan todas las manipulaciones con la planta. Es un habitáculo con un operario en un ambiente estéril. Se usan rayos ultravioletas para esterilizar el aire.

- Medio de cultivo

Agua y nutrientes (hormonas) en un tubo de ensayo, que se tapa con un tapón. Dependiendo del material que se va a propagar, el tubo se pone vertical o un poco inclinado.

- Planta

El material vegetal de partida puede ser del campo, pero esto conlleva un alto riesgo de enfermedades y contaminación, aunque se lave mucho y bien. Lo más corriente es utilizar brotes que crecen en condiciones controlada para que halla menos infecciones.

- Cámara de cultivo

La cámara de cultivo es una habitación de dimensiones muy variables, en la que se controlan las condiciones de luz, temperatura, humedad, variación día-noche, etc..

Condiciones del cultivo in vitro

• • En la cámara de flujo laminar no puede entrar material contaminado. El problema más importante en todo el proceso del cultivo in vitro son las contaminaciones.

• • En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias, como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa, encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes que no soporten altas temperaturas.

• • El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que no suministre al medio sustancias contaminantes para la planta. Normalmente se prepara el medio y se filtra directamente. El problema es que se absorben en el filtro determinadas sustancias.

• • Los reguladores de crecimiento (hormonas) son imprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el medio de cultivo.

• • El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5.

• • Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.

• • El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua, fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.

• • El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos años en prepararlo.

• • En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz (16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan en la oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son 22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC y también 28-30ºC para plantas tropicales.

• • Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagación también influyen determinadas características de la planta, como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte más juvenil o más adulta.

• En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio de gases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría un aumento de la concentración de sales, y por tanto la muerte de la planta. De ahí la importancia del cierre.

Subcultivos o replicado

Cuando sembramos microestaquillas en cultivo in vitro, no nos interesa que se emitan raíces ni hojas, sino que se produzca una proliferación (crecimiento) para obtener nuevas microestaquillas. Son lo que se denominan subcultivos.

No se pueden hacer infinitamente ya que se agota el material vegetal; tan sólo se hace 8-10 veces.

Ocurre entonces lo siguiente:

- El medio nutritivo se agota y se seca.

- El material vegetal ocupa todo el tubo.

- Se produce un cambio de olor en el medio (sustancias tóxicas).

- El medio se hace líquido.

Fases del cultivo de meristemos

1. Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm).

2. Siembra en el medio del tubo.

3. Fase de proliferación: crecimiento de brotes. Subcultivos.

4. Fase de enraizamiento (cambiar el medio).

5. Primera fase de aclimatación. Es muy importante el que la planta pueda llegar o no al campo. Invernaderos, bolsas de plástico, bandejas de vidrio, etc..

6. Segunda fase de aclimatación. Siempre en invernadero.

7. Plantación en el campo.

Fases del cultivo de embriones

Se utiliza mucho en manzano.

1. Se desinfecta el fruto en alcohol. Se flamea.

2. Se coge el embrión de la semilla.

3. Se inocula en el tubo.

4. A las 1-2 semanas, la planta está más o menos reconocible.

5. Se deja crecer y se pasa por las fases de aclimatación.

Micropropagación

Se parte de una yema, de bráctea o axilar.

Se empieza a desarrollar en el medio de cultivo.

Entre la fase de proliferación y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener más plantas).

El número de subcultivos depende del material vegetal.

Ejemplo de micropropagación de Kiwi:

- Se parte de un trozo de tallo.

- Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote.

- En la fase de proliferación intentamos obtener gran cantidad de brotes.

- Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio.

- Al aumentar la concentración de auxinas se obtienen plantas enraizadas.

- Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.

Cultivo de callo in vitro

Se parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta o de una planta que viene de cultivo in vitro.

El medio puede ser sólido o líquido.

Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, o también proembriones, que al unirse forman una estructura similar al embrión.

A partir de entonces se desarrolla normalmente.

Obtención de plantas haploides

Normalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular.

De una yema de flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriogénesis u organogénesis.

• • Embriogénesis: se forman células (poliembriones).

• Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide), o bien del grano de polen (haploide).

No se riega nunca por aspersión (riesgo de patógenos), siempre con regadera.

Problemas en el cultivo in vitro

Contaminación microbiana in vitro de tejidos vegetales. La contaminación en el cultivo de tejidos puede originarse de dos fuentes fundamentales: una llevada a cabo por microorganismos en la superficie o en los tejidos de los explantes, o por deficiencias en la manipulación de los operadores en los laboratorios.

Durante el crecimiento y desarrollo de las plantas, la superficie y la rizosfera están habitadas por microorganismos que pueden entrar al tejido a través de aberturas naturales, heridas, oportunistamente, y llegan a colonizar los tejidos vegetales.

Influencia de los microorganismos en el cultivo in vitro

Los principales microorganismos asociados con la superficie de las plantas son: hongos, levaduras, bacterias, spiroplasmas y micoplasmas. Las áreas donde se concentran mayor cantidad de nutrientes en la superficie de las plantas son: néctar, ceras, tejidos senescentes, etc. Las poblaciones de hongos y bacterias pueden desarrollarse en residuos de insectos, además, las hendiduras, pelos densos y superficies mucilaginosas pueden albergar microorganismos.

Contaminación de las plantas madres

Constituye la mayor fuente de contaminación en el cultivo de tejidos. Puede ser más fácil detectar contaminantes en los tejidos maduros de las plantas donantes cuando hay expresión de síntomas y/o altas poblaciones, que en el cultivo in vitro donde sus manifestaciones y poblaciones pueden estar suprimidas.

Contaminantes microbianos introducidos en el laboratorio

Los microorganismos que se introducen en el laboratorio son generalmente habitantes del suelo que se encuentran en el ambiente; saprofitos o patógenos de las plantas, así como habitantes de la microbiota normal del cuerpo humano que se relacionan con procederes inadecuados en el laboratorio, condiciones higiénico sanitarias deficientes o incumplimientos de la disciplina tecnológica.

Ciertas bacterias entran al cultivo de tejidos con los explantes iniciales pero otras son claramente introducidas en el laboratorio. Entre los hongos filamentosos contaminantes, los géneros encontrados con mayor frecuencia han sido Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Fusarium, Alternaria yNeurospora.

Las bacterias son consideradas como los contaminantes más comunes y las que ocasionan los problemas más serios, porque pueden ser sistémicas, y su detección es más difícil.

* Contaminación: es grave.

* Vitrificación: es una reacción de las plantas que las hace adquirir apariencia de vidrio. La única solución es hacer un subcultivo de material sano, es decir, se saca y se cortan los trocitos que estén bien.

Micropropagación

La micropropagación consiste en tomar pequeñas secciones del tejido de una planta o estructuras enteras, como yemas, y cultivarlas en condiciones artificiales para regenerar plantas completas. La micropropagación es especialmente útil para conservar plantas valiosas, mejorar especies en aquellos casos en que es difícil hacerlo por otros medios (como sucede con muchos árboles), acelerar el mejoramiento de plantas y obtener abundante material vegetal para la investigación.

Por lo que respecta a los cultivos y especies hortícolas, la micropropagación es actualmente la base de una amplia industria comercial en la que participan cientos de laboratorios en todo el mundo. Además de sus ventajas en cuanto a la rapidez de la multiplicación, la micropropagación puede utilizarse para generar material de plantación libre de enfermedades, especialmente si se combina con equipo de diagnóstico para la detección de enfermedades.

Ha habido intentos de utilizar más ampliamente la micropropagación en la silvicultura. En comparación con la propagación vegetativa por estacas, la micropropagación ofrece tasas superiores de multiplicación que permiten una difusión más rápida del material de plantación, aunque los costos más altos y la disponibilidad limitada de los clones deseados impiden que se adopte más ampliamente.

Fuente: ChileBio.cl, Infojardin, Ecured

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