Guía general para la propagación in vitro de berries
Cultivo in vitro de berries: guía técnica completa
Protocolo especializado para la micropropagación in vitro de berries (Vaccinium spp., Rubus spp.)
mediante técnicas de cultivo de tejidos vegetales
Tabla de Contenidos
1. Introducción al cultivo in vitro
El cultivo in vitro o micropropagación de berries representa una técnica biotecnológica fundamental para la propagación masiva de plantas de alta calidad genética. Esta metodología permite obtener plantas libres de patógenos, uniformes y con características superiores a partir de pequeños fragmentos de tejido vegetal.
Ventajas del cultivo in vitro:
- Propagación masiva en espacios reducidos
- Obtención de plantas libres de virus y patógenos
- Conservación de genotipos elite
- Producción independiente de estacionalidad
2. Selección y preparación de explantes
2.1 Material vegetal y fuentes
Criterios de selección:
- Plantas madre: Sanas, vigorosas, libres de plagas y enfermedades
- Material joven: Brotes tiernos o yemas juveniles (2-3 cm)
- Época óptima: Primavera/verano para menor contaminación
- Origen preferido: Plantas de invernadero vs. campo abierto
Para Vaccinium spp. (arándanos), los mejores resultados se obtienen con estacas jóvenes de 2-3 cm. En Rubus spp. (frambuesa, mora) se emplean miniestacas herbáceas o semileñosas del mismo tamaño.
2.2 Protocolo de desinfección
Secuencia de desinfección:
- Limpieza inicial: Lavado con agua corriente y detergente suave
- Pre-tratamiento: Etanol 70% por 30-60 segundos
- Desinfección principal: Hipoclorito de sodio (NaClO) 1-4% por 10-20 minutos
- Tratamiento antimicrobiano: Streptomicina (2 g/L) + Benomil (2 g/L) por 30 min
- Lavados finales: 3 enjuagues con agua destilada estéril
3. Formulación de medios de cultivo
3.1 Medios base específicos
La selección del medio basal es crucial según la especie:
- Vaccinium spp.: WPM (Woody Plant Medium) o medio Anderson (Rhodo) modificado
- Rubus spp.: MS completo (Murashige & Skoog) o variantes reducidas
3.2 Reguladores de crecimiento
Fase de multiplicación:
- Vaccinium: Zeatina (0.5-2.0 mg/L) o 2-iP (2-5 mg/L)
- Rubus: BAP (1-2 mg/L) + GA₃ (0.1-1 mg/L)
- Alternativas: TDZ (0.5-1 mg/L) para mayor proliferación
Fase de enraizamiento:
- Auxinas principales: IBA (0.5-1 mg/L) o AIB (0.2-0.5 mg/L)
- Aditivos: Carbón activado (0.5-1 g/L) para adsorber fitohormonas
- Complementario: GA₃ (0.1-0.5 mg/L) para elongación
3.3 Composición nutricional
Componentes esenciales:
- Sacarosa: 20-30 g/L como fuente de carbono
- pH: Ajustado a 5.2-5.8 antes de gelificar
- Gelificante: Agar (6-8 g/L) o Phytagel (3 g/L)
- Vitaminas: Tiamina, ácido nicotínico, piridoxina
- Mio-inositol: Según formulación estándar MS/WPM
4. Fases del cultivo in vitro
4.1 Establecimiento
El establecimiento constituye la fase crítica donde se logra la supervivencia y activación del explante en condiciones asépticas.
Parámetros clave:
- Duración: 4-6 semanas
- Evaluación: Supervivencia, brotación inicial, ausencia de contaminación
- Medio: Formulación específica según especie con reguladores de establecimiento
4.2 Multiplicación
La multiplicación in vitro permite obtener múltiples brotes a partir de un explante inicial mediante estimulación con citocininas.
Objetivos:
- Máxima proliferación de brotes axilares
- Mantenimiento de calidad morfológica
- Prevención de vitrificación
- Subcultivos regulares cada 6-8 semanas
4.3 Enraizamiento
El enraizamiento in vitro se induce mediante transferencia a medio con auxinas y reducción de citocininas.
Protocolo típico:
- Medio: MS o WPM + IBA (0.5-1 mg/L)
- Duración: 2-4 semanas
- Condiciones: Puede iniciarse en oscuridad 1-2 semanas
- Evaluación: Formación de raíces ≥2-3 cm
4.4 Aclimatación
La aclimatación representa la transición del ambiente in vitro al ex vitro, requiriendo control gradual de las condiciones ambientales.
5. Condiciones ambientales de cultivo
Parámetros Estándar:
- Temperatura: 20-25°C constante
- Fotoperiodo: 12-16 h luz/día
- Intensidad lumínica: 30-50 µmol m⁻² s⁻¹ (800-1000 lux)
- Humedad relativa: 60-80% (controlada por tipo de cierre)
- Ventilación: Ocasional para reducir condensación
6. Control de contaminaciones
Estrategias Preventivas:
- Asepsia rigurosa: Campana de flujo laminar, esterilización de instrumentos
- Material óptimo: Explantes jóvenes (contaminación 4-25% vs >85% madera vieja)
- Antimicrobianos: Antibióticos (50-100 mg/L estreptomicina) si necesario
- Control fenólico: Antioxidantes (ácido ascórbico 100-200 mg/L)
7. Programación de subcultivos
Cronograma Típico:
- Establecimiento: 4-6 semanas (primer subcultivo)
- Multiplicación: 6-8 semanas por ciclo
- Enraizamiento: 2-4 semanas (sin subcultivo)
- Tiempo total: 10-12 semanas hasta aclimatación
8. Problemas técnicos y soluciones
8.1 Oxidación Fenólica
Síntomas: Ennegrecimiento del medio y explante
Soluciones: Antioxidantes, carbón activado, trabajo rápido, material joven
8.2 Vitrificación (Hiperhidratación)
Síntomas: Tallos translúcidos, tejidos blandos
Soluciones: Reducir citocininas, mejorar gelificación, ventilación controlada
8.3 Contaminación Latente
Síntomas: Aparición tardía de microorganismos
Soluciones: Protocolos de desinfección más rigurosos, antibióticos temporales
9. Conclusiones
El cultivo in vitro de berries requiere precisión técnica y control estricto de cada fase del proceso. El éxito depende fundamentalmente de:
- Selección adecuada del material vegetal inicial
- Protocolos de desinfección efectivos
- Formulación específica de medios según especie
- Control ambiental riguroso
- Programación precisa de subcultivos
- Manejo preventivo de contaminaciones
La implementación exitosa de estos protocolos permite obtener plantas de calidad superior con tasas de multiplicación de 1:4 a 1:10 por ciclo, representando una herramienta invaluable para la propagación comercial de berries.
10. Referencias bibliográficas
Fuentes Científicas Consultadas:
- MDPI - Multidisciplinary Digital Publishing Institute
https://www.mdpi.com
Artículos sobre micropropagación de Vaccinium y técnicas de cultivo in vitro - ResearchGate - Red Científica
https://www.researchgate.net
Protocolos de desinfección y establecimiento de cultivos de berries - SciELO Costa Rica
https://www.scielo.sa.cr
Estudios de multiplicación y enraizamiento de Vaccinium spp. - Repositorio TEC - Tecnológico de Costa Rica
https://repositoriotec.tec.ac.cr
Tesis y protocolos de micropropagación de Rubus spp. - Red de Revistas Científicas - Redalyc
https://www.redalyc.org
Investigaciones en mora de Castilla (Rubus glaucus) y técnicas de enraizamiento - Biblioteca Digital Zamorano
https://bdigital.zamorano.edu
Manuales técnicos de cultivo in vitro de arándanos - ORBi - Repositorio Universidad de Liège
https://orbi.uliege.be
Estudios sobre vitrificación y problemas en cultivo de tejidos
Nota Bibliográfica:
Este protocolo se basa en una compilación de literatura científica especializada en micropropagación de berries. Las referencias incluyen artículos peer-reviewed, tesis universitarias y manuales técnicos de instituciones reconocidas en biotecnología vegetal. Para acceder a protocolos específicos, se recomienda consultar las bases de datos científicas mencionadas utilizando términos clave como: "Vaccinium micropropagation", "Rubus in vitro culture", "berry tissue culture protocols".
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