Hace unas pocas semanas, en diversos medios de comunicación una interesante noticia titulaba más o menos así “Genes de resistencia fueron encontrados en una de las regiones más remotas de la tierra”, ¿esperable? absolutamente; sin embargo, esto ocurre más rápido de lo que pensábamos.
De forma resumida, investigadores de la Universidad de Newcastle (UK) muestrearon suelo de la remota región de Svalbard en el Ártico. Análisis de qPCR de dichas muestras sorprendieron a los científicos cuando pudieron cuantificar un gen de resistencia que había sido detectado por primera vez en 2008 en muestras clínicas y en 2010 desde aguas superficiales de Nueva Delhi, lo que hizo teorizar a los investigadores sobre el impacto de las aves migratorias o el efecto antrópico directo como agentes de dispersión de resistencia a casi 13.000 km. Otros hallazgos sorprendentes en bacterias nos hablan de cómo éstas son capaces de “tomar” información genética desde individuos muertos y hacerlos propios, incluso desde especies cercanas, muy común en el género Pseudomonas, donde genes de resistencia a Cu y antibióticos se trasfieren desde Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss) a Pseudomonas viridiflava.
Ahora aterrizando dicha información y llevándola a nuestro trabajo diario en campo nos habla de la alta probabilidad de que poblaciones de Bacterias como Pseudomonas, Xanthomonas u Hongos como Botrytis, Penicillium, Alternaria posean información genética capaz de generar diversas estrategias que resultan en la supervivencia del mismo a pesar de aplicaciones sucesivas de biocidas.
Asumiendo dicha realidad, debemos saber convivir con este problema. Para definir una estrategia anti-resistencia exitosa debemos conocer qué tipo de resistencia que poseemos, en que frecuencias se encuentran dentro de la población; y esto solo se logra monitoreando, por medio de métodos convencionales, de los que hablaremos en esta columna y otros basados en herramientas moleculares, que por su complejidad dejaremos para otra oportunidad.
Foto 1. Prueba de crecimiento miceliar para análisis de sensibilidad a fungicidas, Créditos: Laboratorios Diagnofruit Ltda.
La caracterización de un individuo como resistente a un fungicida o antibiótico se basa, tradicionalmente, en el cálculo de EC50, dosis mínima requerida para controlar el 50% de una población. Si un patógeno es sometido a un biocida sucesivamente, se generará lo que llamamos un proceso de selección, lo que resultará en algún momento en la supervivencia de una pequeña población que si sigue siendo sometida al agente seleccionador terminará dominando el sistema.
Pero el EC50 en nuestra vida diaria en el campo no pasa más allá de ser un dato de laboratorio, entonces:
De forma sencilla debemos primero entender el concepto de individuo Wild Type (WT) o silvestre, en otras palabras, aquellos que nunca han sido sometidos a aplicaciones del biocida a testear. El EC50 de una población WT genera una línea base, en otras palabras, la respuesta pura al control considerando patógeno/ingrediente activo.
A medida que una población es seleccionada su valor EC50 comienza a despegarse del valor base del WT. Para aterrizar lo señalado, para cierta hidroxyanilida el valor EC50 del WT de Botrytis cinerea es entre 0,02-0,01 ppm; luego de una serie de estudios poblacionales determinaron que la dosis discriminatoria para caracterizar a un individuo de B. cinerea como resistente es de 0,1 ppm, lo que quiere decir que bajo un análisis de sensibilidad (con los resguardos de utilizar el mismo protocolo y origen monospórico de la cepa) si el EC50 es >0,1 ppm se debe considerar que posee algún grado de resistencia. Primera etapa del análisis entendida, ahora como utilizo este dato para aplicarlo en mis manejos de campo, para esto es necesario conocer el concepto de: Factor de resistencia (FR).
Considerando un plan de monitoreo y una vez que poseemos el EC50 de un set de individuos de mi predio, debo avanzar a una segunda etapa, que es el cálculo del Factor de Resistencia, que nos va a caracterizar que tan resistente, seleccionado o que tan mutante es un individuo o población.
Figura 1. Definición de Factor de Resistencia y su relación con nivel de selección y eficacia en campo de fungicida , Créditos: Laboratorios Diagnofruit Ltda
FR no es más que el cociente entre el mínimo EC50 de la población o del individuo WT, contrarrestado con el EC50 calculado desde mis aislados. Como se puede observar en la figura 1, este cociente que se puede mover desde 1 a valores mayores a 100 y nos determinará de forma aproximada en qué grado del proceso de selección está mi población. Si mi población presenta un FR=2 significa que, si bien existe un grado de sensibilidad menor a un individuo WT, el proceso de selección es mínimo; en cambio si el FR=70, indica que la población presenta mayor selección siendo 70 veces más resistente que un individuo o población WT.
Este alto grado de resistencia está probablemente asociado a una mutación en su genoma, entonces debemos comenzar a pensar en una estrategia anti-resistencia; pero antes debemos establecer otro paso y es determinar la Frecuencia de Aislados Resistentes.
Como conocemos la dosis discriminatoria para diferenciar un individuo resistente de uno sensible, establecida por literatura u observando valores de poblaciones locales, podemos saber cuál es la frecuencia de individuos resistentes versus sensibles dentro de mi población. Dependiendo del patógeno, del tipo de activo, entre otros antecedentes de análisis, se fija un umbral de riesgo. En general, con un 50% de individuos resistentes ya se podría pensar en problemas de control.
Tenemos entonces, Frecuencia de individuos resistentes y sí además sabemos que tan resistentes son (valor de FR) podemos elaborar, en conjunto con el fitopatólogo, un diagnóstico que nos permita definir la estrategia a seguir; considerando, por ejemplo:
De todos los casos, el caso C es el que más nos debe preocupar y debemos procurar no llegar a esta situación e inmediatamente debemos adoptar medidas de contingencia. Esta situación nos refleja muchos aislados resistentes pululando y además muy mutantes (alto grado de resistencia relacionada generalmente a cambios en el genoma), población altamente seleccionada donde la eficacia de control puede estar comprometida.
En conclusión, aprender a utilizar e interpretar los datos de resistencia es una tarea crucial para su uso en campo, este tipo de monitoreo se debe llevar a cabo con laboratorios de conocida experiencia y con la consulta habitual a fitopatólogos expertos en el tema para definir la mejor estrategia anti-resistencia.
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